稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）

尊龙凯时采用稀释法来评估抗菌剂抑制微生物生长的能力，主要包括微量稀释法和常量肉汤稀释法。琼脂稀释法具有操作简单、成本低、适合高通量筛选等优点，特别适合自动化操作和精准控制药物浓度。肉汤稀释法则直观易操作，更适合于实验室规模的测试，可根据实验需求自由调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

1. 原理

本实验使用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合并溶解于琼脂培养基中，然后接种细菌。通过观察细菌的生长情况，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)。此方法适用于不溶性抗（抑）菌产品。

2. 操作步骤

(1) 抗（抑）菌溶液的配制：在无菌条件下取5ml或5g（固体研磨后）样品，加入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡，使其成为均匀的10%溶液或悬液。
(2) 含抗菌剂培养基的配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液用PBS进行系列两倍稀释，保存于45℃～50℃水浴中待用。
(3) 双倍浓度培养基的制备：称取76g的MH琼脂培养基，溶解于1000ml水中，煮沸溶解后进行121℃压力蒸汽灭菌15分钟，保存于45℃～50℃水浴中待用。
(4) 含抗（抑）菌液培养基的配制：将10ml系列稀释的抗菌液加入培养皿内，再加入10ml的双倍MH琼脂培养基，摇晃混匀后待其凝固。
(5) 用加样器取1μl～2μl的菌悬液（含菌量约为107cfu/ml）点种于含抗（抑）菌液的培养基中，所形成的菌液圈直径约为5mm～8mm（每个点菌量约为104cfu）。
(6) 同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。
(7) 将接种后的平板放置于35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。

3. 评判标准

当菌落生长完全被抑制的最低抗（抑）菌液浓度即为该样品对受试菌的MIC，单个菌落的生长可忽略不计。

营养肉汤稀释法

1. 原理

本实验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过观察细菌的生长情况确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(MIC)。此方法适用于可溶性抑菌产品。

2. 操作步骤

(1) 按2112所示方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的悬液。
(2) 含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水进行系列两倍稀释后，取各稀释度受试液25ml加入到含25ml双倍浓度营养肉汤的试管中。
(3) 取0.1ml的菌悬液（约为108cfu/ml）接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管中，作为试验组样本。
(4) 同样接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤试管，作为阳性对照组样本。
(5) 取2支仅含营养肉汤的试管，作为阴性对照组样本。
(6) 将试验组、阳性对照组和阴性对照组样本放置于37℃培养箱中，培养48小时，观察结果。
(7) 在实验中应计数试验用菌悬液中的活菌，浓度应在5×105cfu/ml至5×106cfu/ml之间。

3. 评判标准

当阳性对照管中出现细菌生长（混浊），而阴性对照管中无细菌生长（透明）时，试验组无菌生长的最高稀释度对应的抗（抑）菌剂浓度即为该样品对受试菌的MIC。